سلام! من یک تامین کننده TET - 213 سلول هستم ، و امروز می خواهم شما را در نحوه انجام رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس روی این سلول ها طی کنم. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس یک تکنیک فوق العاده مفید در دنیای زیست شناسی سلولی است. این به ما کمک می کند تا پروتئین های خاص را در داخل سلول ها تجسم کنیم و درک بهتری از عملکرد و مکان آنها به ما ارائه دهیم.
تهیه TET - 213 سلول
اولین چیزها ابتدا باید سلولهای TET - 213 خود را آماده کنیم. با رشد آنها در یک محیط کشت مناسب شروع کنید. این سلول ها معمولاً در محیط مانند RPMI 1640 با 10 ٪ سرم گاو جنین (FBS) و 1 ٪ پنی سیلین - استرپتومایسین انجام می شوند. سلول ها را در 37 درجه سانتیگراد در یک جو 5 ٪ CO₂ انکوبه کنید.
پس از رسیدن سلول ها به حدود 70 - 80 ٪ ، زمان آن رسیده است که روند رنگ آمیزی را شروع کنیم. شما باید سلولها را روی پوشش های پوشش در یک صفحه 24 - چاه بذر کنید. این کار کنترل سلولها در مراحل رنگ آمیزی را آسان تر می کند. برای انتقال دقیق سیستم تعلیق سلول بر روی روکش ها از پیپت استفاده کنید. حتماً سلول ها را به طور مساوی توزیع کنید.
رفع سلول ها
بعد از اینکه سلول ها به پوشش های پوشش (معمولاً پس از 24 ساعت) وصل شدند ، وقت آن است که آنها را برطرف کنیم. تثبیت بسیار مهم است زیرا ساختار سلول را حفظ می کند و پروتئین ها را در جای خود نگه می دارد. شما می توانید از یک ثابت کننده مانند 4 ٪ پارفورمالدئید (PFA) در نمک بافر (PBS) استفاده کنید. PFA را به اندازه کافی اضافه کنید تا سلول ها را روی پوشش های پوشش بپوشانید و بگذارید حدود 15 تا 20 دقیقه در دمای اتاق بنشیند.
پس از انجام تثبیت ، سلول ها را سه بار با PBS بشویید. هر شستشو باید حدود 5 دقیقه طول بکشد. این به از بین بردن هر گونه تثبیت کننده اضافی از سلول ها کمک می کند.
نفوذ
در مرحله بعد نفوذپذیری است. این مرحله به آنتی بادی ها اجازه می دهد تا سلول ها را وارد کرده و به پروتئین های هدف متصل شوند. از یک عامل نفوذپذیری مانند 0.1 ٪ Triton X - 100 در PBS استفاده کنید. محلول نفوذپذیری را به سلول ها اضافه کنید و بگذارید حدود 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
پس از آن ، سلول ها را سه بار با PBS دوباره بشویید ، دقیقاً مانند مرحله قبل. این تضمین می کند که عامل نفوذپذیری کاملاً از بین رفته است.
مسدود کننده
مسدود کردن یک گام مهم برای جلوگیری از اتصال غیر خاص آنتی بادی ها است. می توانید از یک راه حل مسدود کننده مانند 5 ٪ آلبومین سرم گاو (BSA) در PBS استفاده کنید. محلول مسدود کننده را به سلول ها اضافه کنید و بگذارید حدود 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شود.
جوجه کشی آنتی بادی اولیه
اکنون وقت آن است که آنتی بادی اولیه را اضافه کنیم. آنتی بادی اولیه مخصوص پروتئینی است که می خواهید در سلول های TET - 213 تشخیص دهید. مطابق دستورالعمل سازنده آنتی بادی اولیه را در محلول مسدود کردن رقیق کنید.
محلول مسدود کننده را با دقت از سلولها جدا کرده و آنتی بادی اولیه رقیق شده را اضافه کنید. حتماً سلول ها را به طور کامل با محلول آنتی بادی بپوشانید. سلول ها را با آنتی بادی اولیه یک شبه در 4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. این زمان جوجه کشی طولانی به آنتی بادی اجازه می دهد تا به طور مؤثر به پروتئین هدف متصل شود.
روز بعد ، سلولها را سه بار با PBS بشویید که هر شستشو حدود 5 دقیقه به طول می انجامد. این امر از شر هر آنتی بادی اولیه بی حد و مرز خلاص می شود.
جوجه کشی آنتی بادی ثانویه
پس از جوجه کشی آنتی بادی اولیه ، زمان آنتی بادی ثانویه است. آنتی بادی ثانویه با رنگ فلورسنت برچسب گذاری شده است ، که به ما امکان می دهد پروتئین هدف را تحت میکروسکوپ فلورسانس تجسم کنیم.
مطابق دستورالعمل سازنده ، آنتی بادی ثانویه را در محلول مسدود کننده رقیق کنید. PBS را از سلول ها جدا کرده و آنتی بادی ثانویه رقیق شده را اضافه کنید. سلول ها را در دمای اتاق به مدت حدود 1 تا 2 ساعت در تاریکی انکوبه کنید. محیط تاریک برای جلوگیری از محو شدن رنگ فلورسنت مهم است.
پس از اتمام جوجه کشی ، سلول ها را سه بار با PBS بشویید ، دقیقاً مانند گذشته.
متعصب
از پیش بینی برای تجسم هسته های سلول استفاده می شود. می توانید از رنگ مانند DAPI استفاده کنید (4 '، 6 - Diamidino - 2 - فنیلندول). DAPI را در PBS رقیق کرده و آن را به سلول ها اضافه کنید. بگذارید حدود 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
پس از آن ، سلولها را یک بار دیگر با PBS بشویید تا DAPI اضافی از بین برود.
نصب
سرانجام ، زمان آن رسیده است که روکش ها را روی اسلایدهای میکروسکوپ سوار کنیم. از یک محیط نصب استفاده کنید ، که به نگه داشتن سلول ها کمک می کند و همچنین فلورسانس را حفظ می کند. با دقت یک قطره از محیط نصب را روی یک اسلاید میکروسکوپ قرار داده و سپس روکش را روی قطره معکوس کنید. اطمینان حاصل کنید که هیچ حباب هوا بین پوشش و اسلاید به دام افتاده است.
تصویر سازی
اکنون شما آماده تصویر کردن سلول ها در زیر میکروسکوپ فلورسانس هستید. برای تجسم سیگنال های فلورسنت از آنتی بادی ثانویه و DAPI از فیلترهای مناسب استفاده کنید. برای به دست آوردن نمای خوبی از سلول ها می توانید چندین تصویر را در زمینه های مختلف مشاهده کنید.
با استفاده از پپتیدهای مرتبط در این فرآیند
در طی کشت سلول و فرآیند رنگ آمیزی ، ممکن است برخی از پپتیدها نیز مفید باشد. به عنوان مثال ،(gly14) -humanin (انسان)نشان داده شده است که اثرات مفیدی بر زنده ماندن و عملکرد سلول دارد. می توانید آن را به محیط کشت اضافه کنید تا ببینید آیا بر بیان پروتئینی که در سلولهای TET - 213 مطالعه می کنید ، تأثیر می گذارد یا خیر.
فیبرونکتین CS1 پپتیدمی توان قبل از بذر سلول ، پوشش های پوشش را پوشید. این می تواند اتصال و گسترش سلول را تقویت کند و باعث می شود روند رنگ آمیزی کارآمدتر شود.
اندوتلین - 1 (11 - 21)همچنین ممکن است در مسیرهای سیگنالینگ در سلول های TET - 213 نقش داشته باشد. می توانید آن را به محیط کشت اضافه کنید و سپس مطالعه کنید که چگونه آن را بر بیان پروتئین هدف از طریق رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس تأثیر می گذارد.
پایان
انجام رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس بر روی سلول های TET - 213 می تواند کمی فرآیند مشکل باشد ، اما اگر این مراحل را با دقت دنبال کنید ، باید بتوانید نتایج خوبی کسب کنید. این یک تکنیک قدرتمند است که می تواند بینش ارزشمندی در مورد زیست شناسی این سلول ها به شما بدهد.
اگر علاقه مند به خرید TET - 213 سلول یا هر یک از پپتیدهای مرتبط که در این وبلاگ ذکر شده است ، احساس راحتی کنید تا برای کسب اطلاعات بیشتر به ما دسترسی پیدا کنید و یک بحث تهیه را شروع کنید. ما اینجا هستیم تا در مورد تمام نیازهای زیست شناسی سلولی خود به شما کمک کنیم.
منابع
- Alberts ، B. ، Johnson ، A. ، Lewis ، J. ، Raff ، M. ، Roberts ، K. ، & Walter ، P. (2002). زیست شناسی مولکولی سلول. علوم گارلند.
- Pollard ، TD ، & Earnshaw ، WC (2004). زیست شناسی سلولی. ساندرز