ترانسفکشن یک روش مهم در زیست شناسی مولکولی است که امکان ورود اسیدهای نوکلئیک خارجی را به سلول ها امکان پذیر می کند و محققان را قادر می سازد تا عملکرد ژن ، بیان پروتئین و مسیرهای سیگنالینگ سلولی را مطالعه کنند. سلولهای TET-213 ، یک رده سلولی نوروبلاستوما انسان ، معمولاً در تحقیقات علوم اعصاب به دلیل خاصیت عصبی آنها مورد استفاده قرار می گیرند. در این پست وبلاگ ، من بینش هایی در مورد نحوه انتقال سلولهای TET-213 به طور مؤثر به اشتراک می گذارم ، و تجربه خود را به عنوان یک تامین کننده سلول TET-213 ترسیم می کنم.
درک سلولهای TET-213
قبل از ورود به فرآیند ترانسفکشن ، درک ویژگی های سلولهای TET-213 مهم است. این سلولها از نوروبلاستوما انسانی مشتق شده و از ویژگی های عصبی مانند توانایی گسترش نوریت ها و بیان نشانگرهای عصبی برخوردار هستند. آنها سلولهای چسبنده ای هستند که در شرایط کشت سلول استاندارد به خوبی رشد می کنند ، به طور معمول در یک محیط همراه با سرم گاو جنین (FBS) و آنتی بیوتیک ها.
انتخاب روش ترانسفکشن مناسب
چندین روش برای انتقال سلول ها وجود دارد که هر کدام دارای مزایا و محدودیت های خاص خود هستند. انتخاب روش ترانسفکشن به عوامل مختلفی از جمله نوع اسید نوکلئیک برای ترانسفکت ، نوع سلول و راندمان ترانسفکشن مورد نظر بستگی دارد. در اینجا برخی از روشهای ترانسفکشن متداول برای سلولهای TET-213 آورده شده است:
ترانسفکشن مبتنی بر چربی
ترانسفکشن مبتنی بر لیپیدها یکی از روشهای پرکاربرد برای معرفی اسیدهای نوکلئیک به سلول است. این شامل استفاده از معرفهای مبتنی بر لیپیدها است که مجتمع هایی با اسید نوکلئیک تشکیل می دهند ، که سپس توسط سلولها از طریق اندوسیتوز گرفته می شوند. ترانسفکشن مبتنی بر لیپیدها نسبتاً آسان است و می تواند در بسیاری از انواع سلول ها از جمله سلولهای TET-213 به کارآیی ترانسفکشن بالا برسد.
برق
برق یک روش فیزیکی است که از یک میدان الکتریکی برای ایجاد منافذ موقت در غشای سلولی استفاده می کند و به اسید نوکلئیک اجازه می دهد تا وارد سلول ها شود. این روش به ویژه برای انتقال سلولهایی که انتقال با استفاده از روشهای دیگر مانند سلولهای اولیه دشوار است ، مفید است. با این حال ، الکتروپورینگ می تواند به سلول ها آسیب برساند و ممکن است برای دستیابی به راندمان ترانسفکشن بالا نیاز به بهینه سازی پارامترهای الکتروپوری داشته باشد.
انتقال ویروسی
انتقال ویروسی شامل استفاده از بردارهای ویروسی برای تحویل اسید نوکلئیک به سلول ها است. بردارهای ویروسی از ویروس هایی حاصل می شوند که برای حمل اسید نوکلئیک مورد نظر مهندسی شده اند و می توانند به طور مؤثر سلول ها را آلوده کنند. انتقال ویروسی می تواند به کارآیی ترانسفکشن بالایی برسد و می تواند برای انتقال طیف گسترده ای از انواع سلول ، از جمله سلولهای TET-213 استفاده شود. با این حال ، انتقال ویروسی به تجهیزات و تخصص های تخصصی نیاز دارد و نگرانی های ایمنی بالقوه مرتبط با استفاده از بردارهای ویروسی وجود دارد.
آماده سازی سلول ها برای ترانسفکشن
آماده سازی مناسب سلول برای ترانسفکشن موفقیت آمیز ضروری است. در اینجا برخی از مراحل برای تهیه سلولهای TET-213 برای ترانسفکشن وجود دارد:
کشت سلولی
سلولهای TET-213 را در یک محیط کشت سلول مناسب همراه با FBS و آنتی بیوتیک ها حفظ کنید. برای حفظ مرحله رشد نمایی آنها به طور مرتب سلول ها را عبور می دهد. استفاده از سلولهای سالم و در حال رشد فعال برای ترانسفکشن بسیار مهم است ، زیرا سلولهای موجود در حالت فیزیولوژیکی ضعیف ممکن است راندمان ترانسفکشن کمتری داشته باشند.
بذر سلولی
سلولهای TET-213 را در یک ظرف کشت یا صفحه چند چاه با چگالی مناسب بذر کنید. چگالی بذر بستگی به روش ترانسفکشن و نوع آزمایش دارد. برای ترانسفکشن مبتنی بر لیپید ، چگالی بذر 50-80 ٪ تلاقی به طور معمول توصیه می شود.
انکوباسیون سلولی
سلولهای بذر را در یک انکوباتور مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 ٪ CO2 برای حداقل 24 ساعت قبل از ترانسفکشن انکوبه کنید تا سلول ها بتوانند از فرآیند بذر وصل و بهبود یابند.
انجام ترانسفکشن
پس از آماده شدن سلول ها ، زمان انجام ترانسفکشن است. در اینجا یک پروتکل کلی برای ترانسفکشن مبتنی بر لیپید سلولهای TET-213 وجود دارد:
معرف ترانسفکشن را آماده کنید
برای تهیه معرف ترانسفکشن مبتنی بر لیپید ، دستورالعمل های سازنده را دنبال کنید. به طور معمول ، این شامل رقیق کردن معرف در یک محیط ترانسفکشن مناسب است.
اسید نوکلئیک را آماده کنید
اسید نوکلئیک را برای ترانسفکت ، مانند DNA پلاسمید یا siRNA آماده کنید. اسید نوکلئیک را در یک محیط ترانسفکشن مناسب رقیق کنید.
مجموعه ترانسفکشن را تشکیل دهید
معرف ترانسفکشن رقیق شده و اسید نوکلئیک رقیق شده را در یک لوله مخلوط کرده و در دمای اتاق به مدت 15-30 دقیقه انکوبه کنید تا امکان تشکیل مجتمع ترانسفکشن فراهم شود.
مجموعه ترانسفکشن را به سلول ها اضافه کنید
محیط کشت را از سلول ها جدا کرده و آن را با محیط ترانسفکشن تازه جایگزین کنید. مجتمع ترانسفکشن را به سلول های قطره ای اضافه کرده و صفحه را به آرامی چرخانید تا پیچیده به طور مساوی توزیع شود.
سلول ها را جوجه کشی کنید
سلولهای ترانسفکت شده را در یک انکوباتور مرطوب در 37 درجه سانتیگراد با 5 ٪ CO2 برای مدت زمان مناسب ، بسته به نوع اسید نوکلئیک و آزمایش ، انکوبه کنید. برای ترانسفکشن DNA پلاسمید ، زمان جوجه کشی 24-48 ساعت به طور معمول کافی است که امکان بیان ژن را فراهم کند.
ارزیابی راندمان ترانسفکشن
پس از ترانسفکشن ، ارزیابی راندمان ترانسفکشن برای تعیین موفقیت آمیز ترانسفکشن مهم است. روش های مختلفی برای ارزیابی راندمان ترانسفکشن وجود دارد ، از جمله:
میکروسپی فلورسانس
اگر اسید نوکلئیک ترانسفکت شده پروتئین فلورسنت مانند GFP را رمزگذاری کند ، می توان از میکروسکوپ فلورسانس برای تجسم سلولهای ترانسفکت شده استفاده کرد. درصد سلولهای فلورسنت می تواند به عنوان برآورد راندمان ترانسفکشن استفاده شود.
فلوسیتومتری جریان
از فلوسیتومتری جریان می توان برای تعیین درصد سلولهای ترانسفکت شده بر اساس بیان یک نشانگر فلورسنت یا آنتی ژن سطح سلول استفاده کرد. این روش یک اندازه گیری دقیق تر و کمی از راندمان ترانسفکشن در مقایسه با میکروسکوپ فلورسانس ارائه می دهد.
وسترن بلات یا qPCR
اگر اسید نوکلئیک ترانسفکت شده پروتئین مورد علاقه را رمزگذاری کند ، می توان از وسترن بلات یا qPCR به ترتیب برای تشخیص بیان پروتئین در سطح پروتئین یا mRNA استفاده کرد. این روش می تواند اطلاعاتی در مورد سطح بیان ژن و عملکرد پروتئین ترانسفکت شده ارائه دهد.
عیب یابی مشکلات ترانسفکشن مشترک
ترانسفکشن گاهی اوقات می تواند چالش برانگیز باشد ، و چندین مشکل مشترک وجود دارد که ممکن است رخ دهد. در اینجا برخی از نکات عیب یابی برای مشکلات ترانسفکشن مشترک وجود دارد:
راندمان ترانسفکشن کم
- کیفیت و کمیت اسید نوکلئیک را بررسی کنید. اطمینان حاصل کنید که اسید نوکلئیک خالص و با کیفیت بالا است.
- بهینه سازی شرایط ترانسفکشن ، مانند غلظت معرف ترانسفکشن ، نسبت اسید نوکلئیک به واکنش و زمان جوجه کشی.
- سلامت سلول و زنده ماندن را بررسی کنید. اطمینان حاصل کنید که سلول ها سالم هستند و قبل از ترانسفکشن در حال رشد هستند.
- یک روش ترانسفکشن متفاوت یا معرف را امتحان کنید.
سمیت سلولی
- غلظت معرف ترانسفکشن یا اسید نوکلئیک را کاهش دهید.
- برای به حداقل رساندن آسیب سلول ، شرایط ترانسفکشن را بهینه کنید.
- از یک روش ترانسفکشن متفاوت یا معرف استفاده کنید که برای سلول ها کمتر سمی است.
راندمان ترانسفکشن متغیر
- اطمینان حاصل کنید که سلول ها به طور مساوی و با چگالی مناسب بذر می شوند.
- قبل از اضافه کردن آن به سلول ها ، مجموعه ترانسفکشن را کاملاً مخلوط کنید.
- سلولها را در شرایط مداوم انکوبه کنید تا تنوع به حداقل برسد.
پایان
انتقال سلولهای TET-213 می تواند یک فرایند چالش برانگیز اما با ارزش باشد. با انتخاب روش ترانسفکشن مناسب ، تهیه صحیح سلول ها و پیروی از پروتکل مناسب ، می توانید به کارآیی ترانسفکشن بالایی برسید و نتایج قابل اعتماد بدست آورید. اگر سؤالی دارید یا به انتقال سلول TET-213 نیاز به کمک بیشتری دارید ، لطفاً با ما تماس بگیرید. ما یک تأمین کننده پیشرو در سلول های TET-213 هستیم و می توانیم سلولهای با کیفیت بالا ، معرفهای ترانسفکشن و پشتیبانی فنی را در اختیار شما قرار دهیم.
علاوه بر سلولهای TET-213 ، ما همچنین طیف گسترده ای از پپتیدها را ارائه می دهیم ، از جملهگالانان (انسانی)باسیکلو (RGDFC)وتDynorphin A (1-13) ، آمید ، گوشت خوکبشر این پپتیدها را می توان در کاربردهای مختلف تحقیقاتی مانند علوم اعصاب ، تحقیقات سرطان و کشف مواد مخدر استفاده کرد.
اگر علاقه مند به خرید سلول های TET-213 یا هر یک از پپتیدهای ما هستید ، لطفاً برای بحث در مورد نیازهای خاص خود با ما تماس بگیرید. ما مشتاقانه منتظر همکاری با شما هستیم و به شما در دستیابی به اهداف تحقیق خود کمک می کنیم.
منابع
- Sambrook ، J. ، & Russell ، DW (2001). کلونینگ مولکولی: یک دفترچه آزمایشگاهی. مطبوعات آزمایشگاه بندر بهار سرد.
- Ausubel ، FM ، Brent ، R. ، Kingston ، RE ، Moore ، DD ، Seidman ، JG ، Smith ، JA ، & Struhl ، K. (Eds.). (2002). پروتکل های فعلی در زیست شناسی مولکولی. جان ویلی و پسران.
- چن ، ج. ، و اوکاناما ، H. (1987). تحول با راندمان بالا سلولهای پستانداران توسط DNA پلاسمید. زیست شناسی مولکولی و سلولی ، 7 (8) ، 2745-2752.
- Neumann ، E. ، Schaefer-Ridder ، M. ، Wang ، Y. ، & Hofschneider ، PH (1982). انتقال ژن به سلولهای لیومای موش با استفاده از الکتروپوری در میدان های الکتریکی بالا. مجله Embo ، 1 (7) ، 841-845.
- Naldini ، L. ، Blomer ، U. ، Gallay ، P. ، Ory ، D. ، Mulligan ، R. ، Gage ، FH ، ... & Verma ، IM (1996). تحویل ژن داخل بدن و انتقال پایدار سلولهای غیر زنده توسط یک بردار عدسی. علوم ، 272 (5259) ، 263-267.