چگونه می توان پپتیدهای کاتالوگ را در صورت لزوم پاکسازی کرد؟

در قلمرو تحقیق و توسعه پپتید ، خلوص پپتیدهای کاتالوگ از اهمیت بالایی برخوردار است. ما به عنوان یک تهیه کننده اختصاصی کاتالوگ پپتیدها ، ما اهمیت ارائه محصولات با کیفیت بالا را به مشتریان خود درک می کنیم. بعضی اوقات ، با وجود بهترین تلاش ما در فرآیندهای سنتز و تصفیه اولیه ، ممکن است نیاز به تصفیه بیشتر پپتیدهای کاتالوگ وجود داشته باشد. در این وبلاگ ، روش ها و ملاحظات مختلفی را برای تصفیه بیشتر پپتیدهای کاتالوگ در صورت لزوم بررسی خواهیم کرد.

چرا تصفیه بیشتر؟

دلایل مختلفی وجود دارد که ممکن است تصفیه بیشتر پپتیدهای کاتالوگ لازم باشد. در مرحله اول ، در برنامه های تحقیقاتی بسیار حساس مانند سنجش های مبتنی بر سلول ، در مطالعات داخل بدن یا تحقیقات زیست شناسی ساختاری ، حتی مقادیر کمیاب ناخالصی ها می توانند تأثیر قابل توجهی در نتایج تجربی داشته باشند. ناخالصی ها به طور بالقوه می توانند در فعالیت بیولوژیکی پپتید تداخل داشته باشند و منجر به مثبت یا منفی کاذب شوند.

ثانیا ، الزامات نظارتی در برخی از صنایع ، مانند داروسازی ، برای پپتیدهای مورد استفاده در تولید دارو ، سطح خلوص بسیار بالایی را می طلبد. اگر یک پپتید به عنوان یک عامل درمانی بالقوه در نظر گرفته شود ، هرگونه ناخالصی می تواند خطرات ایمنی بیمار را ایجاد کند ، و بنابراین ، مراحل تصفیه اضافی ضروری است.

روشهای کروماتوگرافی

معکوس - فاز بالا - کروماتوگرافی مایع با عملکرد (RP - HPLC)

RP - HPLC یکی از روشهای پرکاربرد برای تصفیه پپتید است. پپتیدها را بر اساس آبگریز آنها جدا می کند. مرحله ثابت در RP - HPLC یک ماده آبگریز است ، به طور معمول یک ستون مبتنی بر سیلیس با زنجیره های آلکیل متصل (به عنوان مثال ، C18 یا C8). پپتیدها با آبگریزهای مختلف با فاز ثابت متفاوت خواهند بود و در نتیجه زمان احتباس متفاوتی ایجاد می شود.

برای تصفیه بیشتر پپتیدهای کاتالوگ با استفاده از RP - HPLC ، ابتدا باید یک مرحله موبایل مناسب را انتخاب کنیم. یک فاز متحرک متداول از ترکیبی از آب و یک حلال آلی مانند استونیتریل یا متانول تشکیل شده است که با افزودن مقدار کمی از یک اسید (به عنوان مثال ، اسید تری فلوئورواستیک ، TFA) برای بهبود شکل اوج. با تنظیم شیب حلال آلی ، می توانیم جداسازی پپتید هدف را از ناخالصی ها بهینه کنیم.

به عنوان مثال ، اگر پپتید کاتالوگ مانند داریمLL-37 ، پپتید ضد میکروبی، که یک پپتید ضد میکروبی با کاربردهای درمانی بالقوه است ، می توان از RP - HPLC برای حذف هرگونه سنتز باقی مانده توسط محصولات - محصولات یا قطعات تخریب شده استفاده کرد. LL - 37 خالص شده می تواند در سنجش های دقیق تر فعالیت ضد میکروبی مورد استفاده قرار گیرد.

یون - کروماتوگرافی تبادل

کروماتوگرافی یون - تبادل پپتیدها را بر اساس بار آنها از هم جدا می کند. دو نوع اصلی وجود دارد: کروماتوگرافی کاتیون (CEX) و کروماتوگرافی تبادل آنیون (AEX). در CEX ، مرحله ثابت دارای یک گروه با بار منفی است و پپتیدها با بار مثبت خالص به آن متصل می شوند. در AEX ، مرحله ثابت بار مثبت است و پپتیدهای با بار منفی حفظ می شوند.

انتخاب بین CEX و AEX به نقطه ایزوالکتریک (PI) پپتید بستگی دارد. اگر PI پپتید زیر pH فاز موبایل باشد ، پپتید بار منفی خالص خواهد داشت و از AEX استفاده می شود. برعکس ، اگر PI بالاتر از pH فاز موبایل باشد ، CEX مناسب تر است.

به عنوان مثال ،Ureistachykinin II، یک پپتید با مشخصات بار خاص ، با استفاده از کروماتوگرافی یون - تبادل می تواند بیشتر خالص شود. با انتخاب دقیق pH فاز موبایل و قدرت یونی ، می توانیم به جدایی خوبی از پپتید هدف از سایر ناخالصی های بارگذاری شده دست یابیم.

روشهای الکتروفورز

سدیم دودسیل سولفات - الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (SDS - صفحه)

اگرچه SDS - صفحه عمدتاً برای تجزیه و تحلیل پروتئین استفاده می شود ، اما می تواند تا حدی برای تصفیه پپتید نیز استفاده شود. در SDS - صفحه ، پپتیدها توسط SDS دناتوره می شوند و بر اساس وزن مولکولی آنها از هم جدا می شوند. پپتیدها از طریق یک ژل پلی آکریل آمید تحت تأثیر یک میدان الکتریکی مهاجرت می کنند.

پس از الکتروفورز ، ژل می تواند برای تجسم پپتیدها رنگ آمیزی شود. باند مربوط به پپتید هدف را می توان از ژل خارج کرد و پپتید را می توان از ماتریس ژل بیرون آورد. با این حال ، این روش محدودیت هایی دارد. روند شستشو می تواند پیچیده باشد ، و ممکن است در حین تصفیه از بین برود. همچنین ، SDS می تواند به طور کامل از پپتید خالص خارج شود.

الکتروفورز مویرگی (CE)

الکتروفورز مویرگی یک روش جداسازی قدرتمند برای پپتیدها است. این کارآیی جدایی بالا ، زمان تجزیه و تحلیل کوتاه و مصرف نمونه کم را ارائه می دهد. CE پپتیدها را بر اساس نسبت جرم خود به - به - جدا می کند. حالت های مختلفی از CE وجود دارد ، مانند الکتروفورز منطقه مویرگی (CZE) ، الکتروفورز ژل مویرگی (CGE) و کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسل (MEKC).

CZE متداول ترین حالت برای تجزیه و تحلیل و تصفیه پپتید است. در CZE ، پپتیدها در یک مویرگ پر شده با بافر در زیر یک میدان الکتریکی از هم جدا می شوند. جداسازی بر اساس تفاوت در تحرک الکتروفورز پپتیدها است. CE را می توان با روشهای مختلف تشخیص ، مانند جذب اشعه ماوراء بنفش ، فلورسانس و طیف سنجی جرمی ، برای بهبود صحت شناسایی و تصفیه پپتید همراه کرد.

ملاحظات دیگر

حلالیت

حلالیت پپتید عامل مهمی در فرآیند تصفیه است. اگر یک پپتید در حلال های تصفیه حلالیت ضعیفی داشته باشد ، می تواند منجر به بارش در حین تصفیه شود که این امر بر بازیابی و خلوص پپتید تأثیر می گذارد. برای بهبود حلالیت پپتید ، می توانیم pH حلال را تنظیم کنیم ، حلال ها را اضافه کنیم یا از عوامل حلالیت خاص استفاده کنیم.

تحلیل خلوص

پس از تصفیه بیشتر ، تجزیه و تحلیل خلوص پپتید بسیار مهم است. روشهای متداول برای تجزیه و تحلیل خلوص شامل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) ، طیف سنجی جرمی (MS) و رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) است. HPLC می تواند اطلاعاتی در مورد خلوص کروماتوگرافی پپتید ارائه دهد ، در حالی که MS می تواند وزن مولکولی پپتید را تأیید کرده و هرگونه ناخالصی را با توده های مختلف تشخیص دهد. NMR می تواند برای تعیین ساختار و خلوص پپتید در سطح اتمی استفاده شود.

پایان

ما به عنوان یک تأمین کننده کاتالوگ پپتیدها ، ما متعهد هستیم که پپتیدهای با کیفیت بالا را به مشتریان خود ارائه دهیم. در صورت نیاز به تصفیه بیشتر پپتیدهای کاتالوگ ، روشهای متنوعی در اختیار ما قرار می دهیم ، از جمله روشهای کروماتوگرافی ، روشهای الکتروفورز و سایر ملاحظات مانند حلالیت و تجزیه و تحلیل خلوص. با انتخاب دقیق روش تصفیه مناسب و بهینه سازی شرایط تصفیه ، می توانیم اطمینان حاصل کنیم که پپتیدها نیازهای خلوص بالایی از مشتریان خود را برآورده می کنند.

اگر به پپتیدهای کاتالوگ نیاز دارید یا به خدمات تصفیه بیشتری نیاز دارید ، لطفاً برای تهیه و بحث با ما تماس بگیرید. ما مشتاقانه منتظر همکاری با شما هستیم تا نیازهای تحقیق و توسعه پپتید خود را برآورده کنیم.

منابع

1. Snyder ، LR ، Kirkland ، JJ ، & Dolan ، JW (2010). آشنایی با کروماتوگرافی مایع مدرن. ویلی
2. Jorgenson ، JW ، & Lukacs ، KD (1981). الکتروفورز منطقه مویرگی. شیمی تحلیلی ، 53 (8) ، 1298 - 1302.
3. Laemmli ، انگلستان (1970). شکاف پروتئین های ساختاری در طول مونتاژ سر باکتریوفاژ T4. طبیعت ، 227 (5259) ، 680 - 685.